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Test in vitro.

Se vi ricordate, il nostro ultimo aggiornamento illustrava come alcune delle proteine progettate dai giocatori risultassero ripiegate e stabili nella soluzione. D’altro canto, noi apprezziamo l’avere le strutture cristalline di queste proteine per dimostrare che si sono effettivamente ripiegate nelle loro posizioni previste. Il primo passo per avere una struttura cristallina è avere un cristallo di una proteina: qui vogliamo dare uno sguardo più adeguato al processo di cristallizzazione delle proteine.

Qui sopra si può vedere un vassoio di cristallizzazione a 96 pozzetti. Noi utilizziamo un robot per preparare gli esperimenti di cristallizzazione con 96 diverse condizioni per vassoio. Per ogni proteina noi prepariamo 4 vassoi per un totale di 384 condizioni diverse.

 

Ogni “vassoio” da 96, viene diviso in quattro distinte regioni. In alto a destra, un pozzetto quadrato contiene il liquido madre: il “liquido madre” è tipicamente un tampone acquoso con alcuni sali e un’alta concentrazione di precipitanti. Il pozzetto è circondato da tre pozzetti circolari, ognuno dei quali contiene una goccia del campione proteico mescolato con il liquido madre. In questo vassoio i tre pozzetti vengono usati per testare diversi rapporti di concentrazione, con la proteina e il liquido madre combinati in rapporti di 1:1, 2:1 o 1:2.
Ognuno dei 96 pozzetti è sigillato sia dall’aria che dai pozzetti vicini anche se, all’interno di un pozzetto, le tre gocce condividono un’atmosfera (pura) con il serbatoio, in modo che le gocce possano equilibrarsi per diffusione del vapore. Nel tempo l’acqua evapora dalle gocce e si condensa nel serbatoio: mentre diminuisce il volume della goccia, aumenta in maniera graduale la concentrazione proteica nella goccia. Alla fine, la concentrazione proteica raggiunge un “punto critico” e la proteina cristallizza.


Nell’immagine qui sopra, è possibile vedere diversi cristalli che irradiano verso l’esterno da un’unica origine (molto probabilmente una piccola particella di polvere al centro è servita da “seme” per la crescita di tutti i cristalli.
I cristalli non sono naturalmente colorati, ma mostrano bi-rifrangenza, ovvero riflettono le onde luminose in maniera diversa, a seconda dell’orientamento della sorgente luminosa rispetto al reticolo cristallino: quando vengono visualizzati attraverso un microscopio dotato di filtro polarizzante, i cristalli bidirezionali appaiono colorati.
Questi cristalli sembrano sottili e  “piatti”, suggerendo che questo particolare reticolo cristallino si sviluppi facilmente in altezza e larghezza, ma meno facilmente in profondità: a volte questo è indicativo di imperfezioni del “confezionamento” della proteina in cristallo e può limitare la qualità della diffrazione a raggi X. Successivamente cerchiamo di ottimizzare le condizioni di cristallizzazione creando una serie di gocce simili con piccole differenze nella composizione, nella speranza di ottenere cristalli più grandi e più “sostanziosi”. C’è, infatti, la possibilità che uno di questi cristalli diffranga abbastanza bene da produrre una struttura cristallina.
Una volta ottenuto un cristallo di alta qualità, che produca un buon modello di rifrazione a raggi X, è possibile “fissare” la soluzione della struttura cristallina. Una struttura cristallina soluta ci dirà in maniera definitiva se la proteina si è ripiegata come progettato!



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