Scienza e ricerca

Valutazione attuale: 0 / 5

Stella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattiva

Test in vitro.

Se vi ricordate, il nostro ultimo aggiornamento illustrava come alcune delle proteine progettate dai giocatori risultassero ripiegate e stabili nella soluzione. D’altro canto, noi apprezziamo l’avere le strutture cristalline di queste proteine per dimostrare che si sono effettivamente ripiegate nelle loro posizioni previste. Il primo passo per avere una struttura cristallina è avere un cristallo di una proteina: qui vogliamo dare uno sguardo più adeguato al processo di cristallizzazione delle proteine.

Qui sopra si può vedere un vassoio di cristallizzazione a 96 pozzetti. Noi utilizziamo un robot per preparare gli esperimenti di cristallizzazione con 96 diverse condizioni per vassoio. Per ogni proteina noi prepariamo 4 vassoi per un totale di 384 condizioni diverse.

 

Ogni “vassoio” da 96, viene diviso in quattro distinte regioni. In alto a destra, un pozzetto quadrato contiene il liquido madre: il “liquido madre” è tipicamente un tampone acquoso con alcuni sali e un’alta concentrazione di precipitanti. Il pozzetto è circondato da tre pozzetti circolari, ognuno dei quali contiene una goccia del campione proteico mescolato con il liquido madre. In questo vassoio i tre pozzetti vengono usati per testare diversi rapporti di concentrazione, con la proteina e il liquido madre combinati in rapporti di 1:1, 2:1 o 1:2.
Ognuno dei 96 pozzetti è sigillato sia dall’aria che dai pozzetti vicini anche se, all’interno di un pozzetto, le tre gocce condividono un’atmosfera (pura) con il serbatoio, in modo che le gocce possano equilibrarsi per diffusione del vapore. Nel tempo l’acqua evapora dalle gocce e si condensa nel serbatoio: mentre diminuisce il volume della goccia, aumenta in maniera graduale la concentrazione proteica nella goccia. Alla fine, la concentrazione proteica raggiunge un “punto critico” e la proteina cristallizza.


Nell’immagine qui sopra, è possibile vedere diversi cristalli che irradiano verso l’esterno da un’unica origine (molto probabilmente una piccola particella di polvere al centro è servita da “seme” per la crescita di tutti i cristalli.
I cristalli non sono naturalmente colorati, ma mostrano bi-rifrangenza, ovvero riflettono le onde luminose in maniera diversa, a seconda dell’orientamento della sorgente luminosa rispetto al reticolo cristallino: quando vengono visualizzati attraverso un microscopio dotato di filtro polarizzante, i cristalli bidirezionali appaiono colorati.
Questi cristalli sembrano sottili e  “piatti”, suggerendo che questo particolare reticolo cristallino si sviluppi facilmente in altezza e larghezza, ma meno facilmente in profondità: a volte questo è indicativo di imperfezioni del “confezionamento” della proteina in cristallo e può limitare la qualità della diffrazione a raggi X. Successivamente cerchiamo di ottimizzare le condizioni di cristallizzazione creando una serie di gocce simili con piccole differenze nella composizione, nella speranza di ottenere cristalli più grandi e più “sostanziosi”. C’è, infatti, la possibilità che uno di questi cristalli diffranga abbastanza bene da produrre una struttura cristallina.
Una volta ottenuto un cristallo di alta qualità, che produca un buon modello di rifrazione a raggi X, è possibile “fissare” la soluzione della struttura cristallina. Una struttura cristallina soluta ci dirà in maniera definitiva se la proteina si è ripiegata come progettato!


Per commentare questo post nel forum devi effettuare il login

Valutazione attuale: 0 / 5

Stella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattiva

Questa è la seconda parte dell’articolo in cui abbiamo discusso dei recenti miglioramenti della qualità delle catene primarie

Proteine ripiegate
Qui sotto ci sono alcune proteine progettate dai giocatori di Foldit, che sono state espresse e purificate nel laboratorio Baker. I dati sperimentali derivati dalla spettroscopia a discroismo circolare suggeriscono che queste proteine siano stabili e ben ripiegate. La legenda delle immagini è sotto.
Da notare che i nostri test non sono ancora completi – non sappiamo ancora se queste proteine stanno ripiegando nella loro conformazione prevista o in qualche altra struttura alternativa. Per questo avremo bisogno di ulteriori dati con la risoluzione atomica della cristallografia a raggi X o con altri metodi.


Puzzle 1248


Puzzle 1299


LEGENDA:
(A) Diagramma a disegno di ogni proteina progettata dal giocatore di Foldit. Tutti questi disegni sono caratterizzati da α-eliche strette contro un singolo foglietto β, ma non esistono due disegni che abbiano la stessa piega. 
(B) Le predizioni di ripiegamento di Rosetta@home (described here).  Rosetta@home è stata in grado di prevedere correttamente la struttura di ogni singola proteína basandosi sulla sua sequenza di aminoacidi. La nuvola "ad imbuto" di punti rossi che raggiunge l'angolo inferiore sinistro di ciascuna trama, indica che Rosetta è in grado di ricostruire la piega desiderata dalle esclusivamente dalle informazioni di sequenza e che anche la piega prevista è la più stabile.
(C) Lo spettro del discroismo circolare (DC) della proteina purificata rivela che ogni proteina  contiene una struttura secondaria significativa. Questa caratteristica firma del DC – con un evidente “piano” tra i 208 e i 222 nm – suggerisce che sia le alfa eliche che i foglietti beta sono presenti a 25 gradi (traccia blu). Possiamo anche notare che le strutture si conservano, per la maggior parte, a 95 gradi e che quelle perse possono essere recuperate tornando a 25 gradi(traccia verde).
(D) Ogni proteina è abbastanza termostabile, mantenendo un forte segnale DC a 220nm durante il riscaldamento da 25 a 95 gradi. 
(E) Queste proteine vengono dispiegate da un concentrato di Cloruro di Guanidinio (un agente caotropico). La transizione con curva sigmoide ripida dallo stato ripiegato a quello denaturato suggerisce che queste proteine si ripieghino attraverso un meccanismo cooperativo a due stati..

Test di cristallizzazione
Il passo successivo è quello di provare a cristallizzare queste proteine. In condizioni ben specifiche, un campione concentrato di proteina purificata si auto-organizzerà in un reticolo cristallino altamente ordinato. I cristalli di proteine sono utili per noi perché comprendono un gran numero (pensate a trilioni) di molecole proteiche identiche tutte bloccate nello stesso orientamento. Se puntiamo un fascio concentrato di raggi X su un cristallo proteico, gli elettroni nel reticolo cristallino ordinato diffonderanno i raggi X per produrre uno schema di diffrazione ordinato: da questo modello di diffrazione è possibile dedurre la distribuzione degli elettroni ordinati ad una risoluzione veramente alta, sotto forma di una “mappa” della densità degli elettroni, rivelando la struttura atomica della proteina cristallizzata.
Sfortunatamente, la cristallizzazione proteica è un processo molto delicato ed è estremamente sensibile a piccoli cambiamenti delle condizioni. Diverse proteine richiedono condizioni assai diverse per la cristallizzazione, e non c’è modo di prevedere quali condizioni consentano una cristallizzazione di una particolare proteina: la concentrazione di proteine, il tampone usato, il pH, i sali, i ligandi, i precipitanti, la temperatura e il tempo possono essere tutti fattori critici per la crescita del cristallo. In genere, un tecnico cristallografo creerà schermi a numerosi cristalli, incubando proteine concentrate in grandi array con centinaia di condizioni diverse e li osserverà per periodi di settimane o mesi.
In definitiva, la cristallizzazione delle proteine è quasi una lotteria. Molte proteine non sono mai state perfettamente cristallizzate. Ma, con un po’ di fortuna, saremo in grado di sviluppare i cristalli di alcune di queste proteine, raccogliere i dati di diffrazione a raggi X e determinare la loro struttura completa.


Per commentare questo post nel forum devi effettuare il login

Valutazione attuale: 0 / 5

Stella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattiva

Il grafico di Ramachandran o mappa di Ramachandran (da qui in poi "Rama". NDR) è un modo per esaminare la struttura principale di ogni residuo in una proteina.
Questo metodo è stato usato per la prima volta da  G.N. Ramachandran et al. nel 1963 per descrivere le disposizioni stabili dei singoli residui di una proteina.
Oggi, il grafico di Rama è usato frequentemente dai cristallografi per identificare modelli di proteine con strutture irrealistiche.



Come alcuni di voi possono ricordare, ogni residuo di una proteina ha due legami rotanti, che sono chiamati φ e ψ. Se prendiamo una struttura proteica e misuriamo le rotazioni di questi legami (tra -180 e 180 gradi), possiamo tracciare ogni residuo rispetto al suo φ (asse x) e ψ (asse y). Il risultato è il grafico di Rama, in cui ogni punto nero è un residuo di una proteina:


Alcune rotazioni sono più stabili di altre: le aree bianche del grafico Rama sono instabili e un residuo in questo spazio avrà un cattivo punteggio strutturale;
le aree colorate, invece, sono più stabili e i residui avranno un punteggio migliore.
Le aree stabili del grafico Rama in Foldit sono divise in quattro regioni, chiamate regioni ABEGO, e sono colorate in questa maniera:
* Rossa: elica ad andamento destrorso (caratteristica di una α-elica)
* Blu: filamento destrorso (caratteristico del filamento β)
* Verde: elica ad andamento sinistrorso (poco comune, eccetto che per la glicina)
* Gialla: filamento sinistrorso (molto poco comune, eccetto che per la glicina)

Poiché i 20 diversi tipi di amminoacidi hanno proprietà diverse, ogni tipo di amminoacido ha un “profilo Rama” leggermente diverso. Per esempio, la maggior parte degli amminoacidi ha una catena laterale che si “scontra” con la dorsale principale nell’elica sinistrorsa, di modo che le mappe di questi residui hanno solo una debole area verde. Diversamente, la glicina non ha alcuna catena laterale e può facilmente adottare una conformazione a forma di elica a sinistra, quindi la sua mappa ha una grande, intensa zona verde.
Muovendo il mouse sopra un punto nella mappa di Rama per vedere il suo tipo e il numero di residui nell’angolo in alto a destra; cliccando su un punto è possibile vedere il profilo Rama specifico per il suo tipo di amminoacido (questo è anche il residuo nella “Selection Mode”). Cliccando e trascinando un punto, si cambiano le rotazioni ? e ? della struttura dorsale di un singolo residuo. La finestra di visualizzazione nella parte alta della mappa Rama si concentrerà sul residuo selezionato e, semplicemente, mostrerà la configurazione locale della dorsale proteica intorno al residuo. Ogni residuo nella visualizzazione è colorato secondo la regione ABEGO in cui si trova. Lo schema di colorazione ABEGO può essere applicato anche alla console principale di Foldit nelle opzioni di visualizzazione con Visualizza-> AbegoColor.

Le "Congiunzioni ideali"
Durante la progettazione di una proteina ci sono una serie di diverse dorsali che possono connettersi con le α-eliche e i foglietti-β. Tuttavia abbiamo riscontrato che determinati tipi di congiunzioni si verificano di frequente nelle proteine native e che queste “congiunzioni ideali” possono essere distinte dai modelli ABEGO. Per esempio, il modo più comune di connettere due filamenti β è una breve “forcina”

con due residui nella conformazione a spirale sinistrorsa (verde).


La mappa di Rama in Foldit include una galleria di congiunzioni ideali, collocata nel menù a tendina in alto a destra. Ogni menù mostra una manciata di questi congiunzioni, che possono essere usate per connettere alcune combinazioni di eliche alfa e filamenti beta; le congiunzioni sono fornite come riferimento ai giocatori di Foldit e li incoraggiamo a provare ad incorporare queste nelle strutture che stanno progettando. All’interno di ciascun menù, le congiunzioni più comuni sono elencate nella parte superiore, ma un congiunzione meno comune può essere “preferita” a seconda del layout preciso di eliche alfa e foglietti beta di un progetto.
La mappa Rama sarà disponibile per l’uso solo in puzzle selezionati: per accedervi basterà andare sul menù “Azioni” nell’interfaccia nativa o su “Selezione Interfaccia” nel menù principale.


Per commentare questo post nel forum devi effettuare il login

Valutazione attuale: 0 / 5

Stella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattiva

In questo articolo, gli sviluppatori di Foldit vogliono dar conto dell’avanzamento dei lavori e delle migliorie introdotte nel gioco, anche grazie all’ausilio dei volontari.

La qualità della catena principale locale
A differenza dei gruppi α-elica, che i giocatori di Foldit hanno padroneggiato con relativa facilità, il design di foglietti α/β si è rivelato molto più problematico. Per un po’ di tempo abbiamo sospettato che il centro del problema fossero delle conformazioni congiunturali locali sfavorevoli.
In particolare, abbiamo rilevato che le proteine α/β, progettate dai volontari, sembravano avere congiunzioni mai viste in proteine naturali.
Il filtro “Ideal Loop/Congiunzione Ideale”, introdotto lo scorso Giugno, ha aiutato in maniera notevole la progettazione in Foldit e, negli aggiornamenti successivi, abbiamo visto un ulteriore miglioramento della qualità della struttura delle proteine progettate dai volontari. Il riquadro di riepilogo qui sotto mostra la deviazione media delle dorsali nelle proteine migliori progettare da Foldit (si immagini di “rompere” ogni proteina progettata in frammenti di 9 residui, cercando per ogni frammento una proteina naturale che abbia un frammento con catena principale simile e quindi misurando l’RMSD alla corrispondenza più vicina. Se ogni frammento di una catena progettata ha una stretta corrispondenza con una proteina naturale, ci dovrebbe essere un RMSD medio basso; se ci sono regioni del design che hanno una catena insolita, quel design avrà un valore RMSD medio maggiore.



Si può vedere come la qualità della catena principale nelle progettazioni Foldit è migliorata in maniera significativa dopo l’imposizione del filtro “Ideal Loop”, disabilitando il “Ricostruisci”, regolando le torsioni “IdealizeSS” e introducendo il pannello “Blueprint”. La linea tratteggiata segna un valore di riferimento rispetto alle proteine progettate con successo dal laboratorio Baker; tutte le proteine progettate da Koga et al. cadono sotto questa linea. Negli ultimi puzzle in cui è stato utilizzato il Blueprint, si nota che la maggior parte dei progetti proteici di Foldit di alta qualità sono anch’essi al di sotto di quella linea.

Gli imbuti (energetici) di ripiegamento di Rosetta@home
Il miglioramento delle catene principali in Foldit si riflette in altri tipi di analisi. Con le dorsali migliorate, infatti, Rosetta@Home è in grado di prevedere meglio la struttura delle proteine progettate in Foldit a partire dalle loro sequenze di aminoacidi (spiegato qui). Di seguito sono riportate alcune proteine dei giocatori di Foldit che sono state ripiegate con successo da Rosetta@home, ma tutte provenienti da puzzle che hanno usato il filtro “Ideal Loop”. La “forte” forma ad imbuto di ogni trama indica non solo che Rosetta è in grado di campionare il ripiegamento desiderato (notare i numerosi punti rossi con RMSD inferiore a 2 Angstrom), ma anche che Rosetta può predire la struttura più stabile. Si confrontino questi modelli con quelli precedenti.


Puzzle 1245


Puzzle 1257


Puzzle 1299


Ognuna delle simulazioni qui sopra è stata traslata inversamente in DNA sintetico, inserito in un organismo E. Coli ed espresso nel nostro laboratorio per ulteriori test. Tuttavia, negli esempi, abbiamo omesso alcuni design particolarmente promettenti, che stanno già mostrando risultati incoraggianti.
Un grosso ringraziamento a tutti i volontari di Foldit che, settimanalmente, ci aiutano a progettare nuove proteine: stiamo imparando molto dai vostri contributi e apprezziamo particolarmente la vostra pazienza e persistenza con i nuovi tools e filtri.


Per commentare questo post nel forum devi effettuare il login

Valutazione attuale: 0 / 5

Stella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattivaStella inattiva

I giocatori entrano nel laboratorio
La scorsa settimana il laboratorio del Baker ha ordinato materiali per costruire l'ultima serie di disegni Foldit in laboratorio per sperimentazioni sperimentali! I seguenti design proteici sono stati selezionati in base all’ispezione visiva dei nostri scienziati e alle previsioni di ripiegamento dal progetto Rosetta@Home.
Per ogni progetto qui sotto abbiamo incluso, a sinistra, l’immagine creata dal giocatore di Foldit; a destra l’imbuto pieghevole con l’energia e l’RMSD del C-alfa per 100 mila secondi sulle previsioni di Rosetta@Home (in rosso), nonché l’immagine della previsione dell’energia più bassa. Ci piace vedere che la previsione dell’energia più bassa ha anche un basso RMSD.

Design di Monomeri
Nel design di monomeri, siamo particolarmente interessati alle diverse topologie contenenti alcuni foglietti beta come strutture secondarie. Queste topologie sono notevolmente più difficili da progettare rispetto ai fasci elicoidali che hanno avuto successo in passato.
Di conseguenza questi imbuti di ripiegamento possono apparire meno puri, ma siamo comunque entusiasti per la sperimentazione in laboratorio!



Design di oligomeri simmetrici
Per la progettazione di omo-oligomeri simmetrici, facciamo una analisi simile per essere sicuri che il monomero si ripieghi come aspettato. Vogliamo anche assicurarci che, una volta ripiegate, le unità monomero si leghino, probabilmente, tra di loro nell'orientamento corretto. Il motivo più comune per cui un progetto non riesce a fare questo test "di ripiegamento" è che la sua interfaccia è completamente idrofobica e priva di caratteristiche. In questo caso, due monomeri opportunamente piegati possono unirsi in diversi modi per coprire la stessa quantità di superficie idrofoba. Il modo migliore per assicurare il legame specifico nell'orientamento corretto è quello di progettare superfici robuste e
complementari (ad esempio grandi catene laterali interdigitate) e, poi, incorporare reti di legami-idrogeno nell'interfaccia.
I seguenti progetti simmetrici sono stati eseguiti in maniera sufficiente per entrambi i test di ripiegamento e docking  dei monomeri (dati non visibili) e siamo ansiosi di provarli – tuttavia pensiamo ci sia ancora spazio per miglioramenti nella progettazione di interfacce specifiche!



I giocatori responsabili dei disegni qui sopra meritano certamente un riconoscimento, ma ci sono vari disegni molto più emozionanti che sono ancora in fase di analisi. Non vediamo l'ora di vedere cosa i giocatori di Foldit riusciranno a far uscire con il prossimo aggiornamento!


Per commentare questo post nel forum devi effettuare il login

Articoli

Written on 17/05/2017, 20:41 by boboviz
le-novità-di-foldit-2Questa è la seconda parte dell’articolo in cui abbiamo discusso dei recenti miglioramenti della qualità delle catene primarie Proteine ripiegateQui sotto...

Ultime dal Blog

Written on 17/05/2017, 20:34 by boboviz
il-blog-di-folditCari sodali dello scaccolo, abbiamo pensato di raccogliere tutti gli articoli degli amministratori del progetto Fold.it in una unica sezione indicizzata,...