Valutazione attuale: 5 / 5

Stella attivaStella attivaStella attivaStella attivaStella attiva
 

Fin dal nostro ultimo post, abbiamo condotto un esperimento di diffrazione a raggi-X con uno dei nostri cristalli proteici. Siamo stati fortunati che i cristalli di proteine hanno prodotto dati di diffrazione di alta qualità e che, da questi dati, siamo riusciti a risolvere la prima struttura in cristallo di una proteina progettata dai giocatori di Foldit: una corrispondenza quasi esatta alla struttura progettata! Di seguito spieghiamo un po' di più sulla diffrazione a raggi X, mentre in un post successivo esamineremo più dettagliatamente la struttura finale.
Per prima cosa, il cristallo proteico viene raccolto dalla goccia usando un piccolo anello di nylon, di circa 0,3 mm di diametro. I cristalli di proteine sono spesso molto fragili, per cui “prendere al lazo” il cristallo richiede una mano costante (come, per esempio, nel dosaggio ottimale del caffè). Anche nell’asola, il cristallo è ancora immerso nella soluzione acquosa, con la tensione superficiale che contribuisce a mantenere il cristallo nell’asola. L’asola viene rapidamente sommersa in azoto liquido, ad una temperatura di circa -200 ° C, che spegne la maggior parte del movimento termico delle molecole nel cristallo.



Una volta congelato, il nostro cristallo è montato su un braccio robotico che posiziona il ciclo nel percorso a raggi X. Durante l'esposizione ai raggi X, il cristallo viene mantenuto sotto un flusso costante di azoto liquido per limitare l'aumento della temperatura nel cristallo: i raggi X hanno un'elevata energia e solo così, con il freddo, un cristallo di proteine può sopportare così tanta esposizione ai raggi prima di cominciare a degradarsi. Il reticolo della proteina potrebbe disintegrarsi a causa dell'aumento del movimento termico delle singole molecole proteiche, oppure i raggi X potrebbero innescare reazioni chimiche all'interno della proteina, distorcendo la sua struttura.
I raggi X sono, semplicemente, un tipo di radiazione elettromagnetica con una lunghezza d'onda molto breve - in questo caso circa un angstrom. In un esperimento di diffrazione a raggi X, è importante che tutte le radiazioni abbiano esattamente la stessa lunghezza d'onda e si concentrino in un fascio molto stretto. Con il nostro cristallo montato nel percorso del fascio a raggi X, un rivelatore di raggi X è posizionato dietro il cristallo e misura i raggi incidenti dopo questi hanno colpito il cristallo e sono diffratti dagli elettroni delle molecole proteiche. A causa della disposizione regolare degli atomi nel cristallo proteico, i raggi X diffratti subiscono interferenze “costruttive” in particolari direzioni: questo si verifica quando due "fette" equivalenti del cristallo sono orientate per coincidere con la lunghezza d'onda dei raggi X. Ovunque si verifichi un'interferenza costruttiva, il rilevatore registra un segnale particolarmente intenso, mostrato come punto scuro sull'immagine qui sotto; presi insieme questi punti comprendono un modello di diffrazione.


Questo sopra è un modello di diffrazione di raggi X di un cristallo proteico. Nell’inserto a destra, possiamo vedere che alcuni punti sembrano avere dei duplicati che sono leggermente deviati: questo indica che ci sono attualmente due cristalli identici nel percorso del raggio, orientati in maniera leggermente diversa. Molto probabilmente, il cristallo si è “fratturato” in due durante il congelamento (fortunatamente il software di elaborazione delle immagini che utilizziamo è abbastanza sofisticato da correggere questo problema).
La distanza e la posizione dei punti è governata dalla dimensione e dalla forma della “cellula unitaria” del cristallo, l’unità ripetuta che costituisce il cristallo. L'intensità di ogni punto è determinata dalla distribuzione degli elettroni all'interno della cellula unitaria (cioè le posizioni degli atomi nella proteina). Ogni atomo della cellula unitaria contribuisce ad ogni punto nello schema di diffrazione. Se si potesse cambiare la densità degli elettroni intorno ad un solo atomo della proteina cristallizzata, questo cambierebbe l'intensità di ogni punto nel modello di diffrazione!
Si noti che le macchie più lontane dal centro del rivelatore tendono ad essere meno intense: i punti più lontani contengono dati di maggior risoluzione circa la densità elettronica della proteina. Se aggiustiamo il contrasto di questa immagine, si possono individuare macchie vicino al bordo del rivelatore: questa proteina diffrange i raggi X ad una risoluzione limite di 1,2 amstrong! In una mappa di densità di elettroni derivata da questi modelli di diffrazione, dobbiamo essere in grado di distinguere le posizioni di singoli atomi.


Se il cristallo viene ruotato rispetto al fascio a raggi X, si osserverà un altro modello di diffrazione, poiché un nuovo orientamento produce interferenze costruttive in direzioni diverse. Di solito misuriamo un nuovo modello di diffrazione a intervalli di rotazione di 0,5 gradi, eventualmente ruotando il cristallo per un totale di 180 gradi (a volte meno per cristalli altamente simmetrici) al fine di raccogliere un set di dati completo. Questo set di dati è stato raccolto con un rivelatore all'avanguardia che può misurare i singoli fotoni; la raccolta di un set di dati completo non richiede più di qualche minuto. Nei "primi giorni" della cristallografia delle proteine (gli anni 60), per raccogliere un set di dati completo poteva richiedere un intero giorno!
La lavorazione e l'interpretazione di questi modelli di diffrazione dei raggi X è una procedura complessa e molto tecnica, e non lo approfondiremo qui. Ma sia sufficiente dire che i dati di diffrazione dei raggi X hanno rivelato una struttura cristallina piena e ad alta risoluzione di questa proteina progettata dai giocatori di Foldit!


Congratulazioni a Waya, Galaxie, e Susume che hanno contribuito alla soluzione del Puzzle 1297! Tutti i giocatori dovrebbero controllare Puzzle 1384 per esplorare la raffinata mappa di densità elettronica da questi dati e vedere se è possibile ripiegare la sequenza proteica nella sua struttura di cristallo! Faremo seguire, poi, un confronto più dettagliato del modello progettato e della struttura cristallina finale.



Per commentare questo post nel forum devi effettuare il login

Articoli

Written on 13/07/2017, 22:23 by boboviz
cristallografia-a-raggi-xFin dal nostro ultimo post, abbiamo condotto un esperimento di diffrazione a raggi-X con uno dei nostri cristalli proteici. Siamo stati fortunati che i...

Ultime dal Blog

Written on 19/06/2017, 14:38 by boboviz
addio-lugano-bellaCari sodali scaccolatori,come alcuni di voi sanno, il sottoscritto, oltre ad essere appassionato di Boinc, è anche "appassionato" di HPC e, visto che il...