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Questa è la seconda parte dell’articolo in cui abbiamo discusso dei recenti miglioramenti della qualità delle catene primarie

Proteine ripiegate
Qui sotto ci sono alcune proteine progettate dai giocatori di Foldit, che sono state espresse e purificate nel laboratorio Baker. I dati sperimentali derivati dalla spettroscopia a discroismo circolare suggeriscono che queste proteine siano stabili e ben ripiegate. La legenda delle immagini è sotto.
Da notare che i nostri test non sono ancora completi – non sappiamo ancora se queste proteine stanno ripiegando nella loro conformazione prevista o in qualche altra struttura alternativa. Per questo avremo bisogno di ulteriori dati con la risoluzione atomica della cristallografia a raggi X o con altri metodi.


Puzzle 1248


Puzzle 1299


LEGENDA:
(A) Diagramma a disegno di ogni proteina progettata dal giocatore di Foldit. Tutti questi disegni sono caratterizzati da α-eliche strette contro un singolo foglietto β, ma non esistono due disegni che abbiano la stessa piega. 
(B) Le predizioni di ripiegamento di Rosetta@home (described here).  Rosetta@home è stata in grado di prevedere correttamente la struttura di ogni singola proteína basandosi sulla sua sequenza di aminoacidi. La nuvola "ad imbuto" di punti rossi che raggiunge l'angolo inferiore sinistro di ciascuna trama, indica che Rosetta è in grado di ricostruire la piega desiderata dalle esclusivamente dalle informazioni di sequenza e che anche la piega prevista è la più stabile.
(C) Lo spettro del discroismo circolare (DC) della proteina purificata rivela che ogni proteina  contiene una struttura secondaria significativa. Questa caratteristica firma del DC – con un evidente “piano” tra i 208 e i 222 nm – suggerisce che sia le alfa eliche che i foglietti beta sono presenti a 25 gradi (traccia blu). Possiamo anche notare che le strutture si conservano, per la maggior parte, a 95 gradi e che quelle perse possono essere recuperate tornando a 25 gradi(traccia verde).
(D) Ogni proteina è abbastanza termostabile, mantenendo un forte segnale DC a 220nm durante il riscaldamento da 25 a 95 gradi. 
(E) Queste proteine vengono dispiegate da un concentrato di Cloruro di Guanidinio (un agente caotropico). La transizione con curva sigmoide ripida dallo stato ripiegato a quello denaturato suggerisce che queste proteine si ripieghino attraverso un meccanismo cooperativo a due stati..

Test di cristallizzazione
Il passo successivo è quello di provare a cristallizzare queste proteine. In condizioni ben specifiche, un campione concentrato di proteina purificata si auto-organizzerà in un reticolo cristallino altamente ordinato. I cristalli di proteine sono utili per noi perché comprendono un gran numero (pensate a trilioni) di molecole proteiche identiche tutte bloccate nello stesso orientamento. Se puntiamo un fascio concentrato di raggi X su un cristallo proteico, gli elettroni nel reticolo cristallino ordinato diffonderanno i raggi X per produrre uno schema di diffrazione ordinato: da questo modello di diffrazione è possibile dedurre la distribuzione degli elettroni ordinati ad una risoluzione veramente alta, sotto forma di una “mappa” della densità degli elettroni, rivelando la struttura atomica della proteina cristallizzata.
Sfortunatamente, la cristallizzazione proteica è un processo molto delicato ed è estremamente sensibile a piccoli cambiamenti delle condizioni. Diverse proteine richiedono condizioni assai diverse per la cristallizzazione, e non c’è modo di prevedere quali condizioni consentano una cristallizzazione di una particolare proteina: la concentrazione di proteine, il tampone usato, il pH, i sali, i ligandi, i precipitanti, la temperatura e il tempo possono essere tutti fattori critici per la crescita del cristallo. In genere, un tecnico cristallografo creerà schermi a numerosi cristalli, incubando proteine concentrate in grandi array con centinaia di condizioni diverse e li osserverà per periodi di settimane o mesi.
In definitiva, la cristallizzazione delle proteine è quasi una lotteria. Molte proteine non sono mai state perfettamente cristallizzate. Ma, con un po’ di fortuna, saremo in grado di sviluppare i cristalli di alcune di queste proteine, raccogliere i dati di diffrazione a raggi X e determinare la loro struttura completa.



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