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La storia del design proteico in Foldit


Come discusso in un precedente post , alcune soluzioni dei giocatori di Foldit ricavate da un puzzle sono state scelte per la sintesi nel laboratorio Baker. Un design in particolare, dal puzzle 854, ha recentemente prodotto alcuni risultati promettenti nel “laboratorio umido”. Qui sotto seguiamo il processo di test.

1. Una volta selezionato il design da sintetizzare in laboratorio, ne estraiamo la sequenza di aminoacidi e ne facciamo una trascrizione inversa in una sequenza di basi DNA (un gene, per esempio), aggiungendo un “tag” speciale che ci sarà utile più avanti.



2. Noi ordiniamo questo gene come una molecola di DNA da un gruppo di sintesi del gene, e uniamo il gene in un pezzo circolare più grande del DNA chiamato plasmide. Il plasmide, che ora contiene il nostro gene, è inserito nei batteri E. coli, che possiamo far crescere e riprodursi in un incubatore. Questi batteri trascrivono e traducono il nostro gene come se fosse uno dei loro, producendo il nostro design come una catena di polipeptidi; se il disegno della proteina è “buono”, la catena del polipeptide si ripiegherà naturalmente nella struttura di progettazione.
3. Una volta che i batteri sono cresciuti fino alla saturazione e producono una grande quantità di proteine, “apriamo” le cellule batteriche e separiamo la nostra proteina da quelle dell’E.Coli, usando il tag speciale che abbiamo inserito nel passaggio 1. A questo punto, possiamo vedere se i batteri sono stati in grado di produrre la nostra proteina e se essa è solubile. Le proteine non strutturate, di solito, saranno degradate dall’E. Coli o saranno in forma insolubile.

SDS-PAGE. Un campione di proteine mescolate (blu colorato) viene passato attraverso un gel di poliacrilamide dall'alto verso il basso, in modo che le proteine più piccole si muovano più velocemente attraverso il gel. Qui sono mostrati tre campioni: tutte le proteine solubili da un batterio (sinistra), proteine che non hanno il tag speciale che abbiamo inserito nello step1 (in mezzo) e le proteine con il tag speciale (destra). Anche se i primi due campioni hanno molte bande (diverse proteine) che si diffondono lungo la lunghezza del gel, il campione a destra è “dominato” da una singola grande macchia (la nostra proteina) vicino alla parte inferiore del gel.


4. Usiamo la cromatografia di esclusione molecolare (SEC), che separa le proteine in base alla loro dimensione, per liberarsi di altre impurità proteiche. Questo passaggio ci fornisce anche informazioni sullo stato oligomerico delle nostre proteine (le proteine instabili con residui idrofobici esposti tendono ad auto-associarsi in oligomeri). I monomeri strutturati si comporteranno in modo diverso sulla colonna rispetto agli oligomeri o agli aggregati non strutturati.


Traccia SEC. Le proteine sono fatte passare attraverso una matrice tale che le proteine più grandi percorrano più velocemente la stessa, e vengano “raccolte” prima (all’estremità sinistra dell’asse delle x); l’assorbanza dei raggi UV è usata per misurare la concentrazione proteica (asse delle y) dei campioni così come vengono raccolti. E’ possibile notare che, nel caso della nostra proteina, questo passaggio non fosse strettamente necessario, dal momento che la proteina era insolitamente pura, evidenziata da un solo picco dominante a 14ml. Infatti, il posizionamento a 14ml corrisponde esattamente alla dimensione prevista dal design, indicando che la proteina è monomerica.

5. Dopo aver purificato la nostra proteina, possiamo usare il dicroismo circolare (CD) per misurare la sua struttura secondaria. Questa tecnica misura l’assorbimento, da parte di una proteina, della luce polarizzata circolarmente e può dirci, all’incirca, la quantità di α-eliche o di β-foglietti in una proteina. Questa misura, inoltre, permette di monitorare come la proteina si dispieghi con l’aumentare della temperatura.

Dicroismo Circolare. Differenti elementi della struttura proteica interagiscono in maniera diversa con la luce polarizzata circolare. A 25 gradi centigradi (traccia blu, in alto) la nostra proteina mostra un DC tipico di una proteina con un notevole contenuto di α-eliche. A 95 gradi (traccia roda, in alto), la forma del profilo è meno evidente, ad indicare una perdita di struttura secondaria; struttura secondaria che viene “recuperata” tornando a 25 gradi (traccia verde, in alto). La traccia inferiore mostra come il segnale del DC a 220 nm cambi quando viene aumentata la temperatura del campione proteico. Il passo graduale di questa traccia indica uno sviluppo non cooperativo e multi-stato.

La proteina sopra è in fase di preparazione per la cristallizzazione. Se riuscisse, potremmo ottenere una struttura cristallina ad alta definizione della proteina e fare un confronto con la proteina progettata.



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